【產(chǎn)品名稱】牛結(jié)節(jié)性皮膚病野毒株P(guān)CR試劑盒

【包裝規(guī)格】 50T/盒

【產(chǎn)品方法】實時熒光PCR法

【預期用途】

適用于牛結(jié)節(jié)性野毒株檢測，可用于臨床牛結(jié)節(jié)性野毒株感染的輔助診斷，但不作確診使用。

牛結(jié)節(jié)性皮膚病野毒株P(guān)CR試劑盒【檢驗原理】

牛結(jié)節(jié)性野毒株檢測試劑盒針對牛結(jié)節(jié)性野毒株的高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含牛結(jié)節(jié)性野毒株基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道信號進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

RT-PCR反應(yīng)液、混合酶液、陽性對照、陰性對照。

【儲存條件及有效期】

避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期為12個月。

【適用儀器】
ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【檢驗方法】

試劑準備（試劑準備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數(shù)

（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

（4）蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。

2.樣本準備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN、Roche公司DNA提qu試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5μl、終體積25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

PCR（PCR擴增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應(yīng)管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。

2.標本結(jié)果判定：

（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標本進行重復檢測，如重復實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。

（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗方法的局限性】

當檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

本試劑盒僅供標本初步篩查使用，對于本試劑盒檢測陽性結(jié)果應(yīng)進一步使用培養(yǎng)法進行確診。

【注意事項】

使用本試劑盒的實驗室，應(yīng)嚴格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理；

為避免RNA降解，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理；

各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染；檢測結(jié)束后，應(yīng)立即對工作臺清潔；

吸取反應(yīng)液時，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準確；

試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時離心；

試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū)，并單獨存放；

為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進行任何標記；

檢測過程中使用過的吸頭，應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi)，檢測結(jié)束的PCR 反應(yīng)管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同后丟棄；工作臺及各種實驗用品應(yīng)定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒；

9.儀器擴增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置；不同批號試劑不能混用；并在有效期內(nèi)使用。

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